Phần 1
Tổng Quan tài liệu
1.1 Đặc điểm cây đu đủ
1.1.1 Nguồn gốc và phân loại:
Đu đủ (Carica papaya L.) thuộc giống Carica, chi Caricaeae, họ hai lá
mầm. Trong chi còn 3 giống khác là Cyclimorpha, Jacaratia và Jarilla. Đu đủ đợc
biết có tới 45 loài trong giống Carica (Willis 1973).
Các loài của Carica papaya L. đã đợc tìm thấy dạng dại trong tự nhiên. Nó
có thể đợc bắt đầu từ vùng đất thấp của Trung Mỹ, giữa Nam Mexico và
Nicaragua (Story 1969), có thể từ sự lai giống giữa hai loài Carica Mexico. Đu đủ
đợc phát tán dọc theo đờng biển thơng mại vùng nhiệt đới nhờ những ngời thám
hiểm và nhà buôn vào giữa thế kỷ 16. Năm 1601, ngời Bồ Đào Nha đã phổ biến
cây đu đủ tới ấn độ và Malaca, ngời Tây Ban Nha đã đa cây đu đủ vào Philippin
Ngày nay, đu đủ có thể thấy trong phạm vi từ vĩ tuyến 32
0
Bắc đến 32
0
Nam của
xính đạo. Nó đợc trồng phổ biến trong đồn điền hoặc mùa vụ tiểu nông.
Đu đủ là loại cây trồng cho quả ăn nhỏ, dạng cây thảo. Cây sinh trởng lâu
năm nhng thời kỳ cây con ngắn, trung bình khoảng 6 tháng. Sau một năm có thể
cho thu hoạch quả chín và sau đó là thu hoạch liên tục trong vòng nhiều năm. Hầu
hết cây trồng mang tính thơng mại chỉ đợc thu hoạch trong vòng 3 hoặc 4 năm trớc
khi tàn lụi và cây trở lên quá cao gây khó khăn cho việc thu hoạch. Một cây cho
sản lợng từ 30 đến 40 kg quả chín trong một năm. Năng suất từ 30 - 40 tấn/ha/năm
và có thể đạt 100 tấn/ha/năm.
5
Đu đủ là cây đa tính, nhiều loài là khác gốc (cây đực và cái riêng rẽ), nhiều
loài là cùng gốc (cây lỡng tính). Cây khác gốc phải đợc thụ phấn chéo do sự chia rẽ
của nhị và nhuỵ hoa và hầu nh sự phân tán của phấn hoa là nhờ gió. Cây cùng gốc
có hoa lỡng tính nên có hiện tợng tự thụ phấn.
1.1.2. Giá trị dinh dỡng và kinh tế của cây đu đủ
Đu đủ đợc sử dụng chủ yếu là quả chín làm món ăn tráng miệng vì quả có
vị ngon, rất giầu vitamin và muối khoáng(Table 1), một phần quả xanh đợc dùng
làm salad, lá xanh dùng để hầm thịt trong một số món ăn truyền thống. Ngoài ra,
nhựa đu đủ còn đợc sử dụng làm nguyên liệu tách chế phẩm papain (chiếm 1%
chất khô của quả xanh) là enzim thơng mại đợc sử dụng trong công nghiệp thực
phẩm và thuộc da. Thêm nữa, đu đủ còn đợc coi là một loại dợc liệu quí: rễ, hoa, lá
đợc dùng rộng rãi trong đông y nh hoa đu đủ đực đợc dùng để trị ho, hạt dùng làm
thuốc chống giun sán, hạ sốt (Vũ Công Hậu)
Table 1: Thành phần dinh dỡng của quả đu đủ chín (100g)
Thành phần 100g quả chín
Năng lợng 35.0 - 59 cal
Nớc 88.4 - 90.7 g
Protein 1.0 - 1.5 g
Chất béo 0.1 g
Carbohydrates 7.1 - 13.5 g
Ash 0.1 g
Calcium 11.0 - 31.0 mg
Phospho 7.0 - 17 mg
Iron 0.6 - 0.7 mg
Sodium 2.0 - 3.0 mg
Potassium 39 - 337 mg
Carotene 1.16 - 2.43 mg
Vitamin B1 0.03 - 0.08 mg
Vitamin B2 0.7 - 0.15 mg
Niacin 0.1 mg
Vitamin C 69.3 - 71.0 mg
Sản lợng quả đu đủ chín ở nớc ta ớc tính đạt 100.000 tấn/năm. Mỗi kg quả
chín trị giá khoảng 2500đ đến 3500đ thì tổng giá trị đạt từ 2500 - 3500 tỉ đồng
(khoảng 150 -200 triệu USD).
6
Tổng sản lợng quả đu đủ tơi trên thế giới năm 1995 ớc tính đạt 5.9 triệu tấn
đạt giá trị khoảng 15 đến 20 tỉ USD (Sản lợng quả đu đủ hàng năm của một số nớc
sản xuất chính đợc đa ra trong bảng 2).
Bảng 2: Sản lợng quả đu đủ hàng năm của một số nớc
Nớc sản xuất Tổng sản lợng các năm ( x1000 tấn)
1984 1987 1990 1993 1995
Châu Phi 237 247 282 -
Nam Mỹ - - 685 723 754
Bắc Mỹ - - 1697 1738 1872
Hawaii - - - 2866 3208
Thailan - - 206.5 363 342.9
Malaysia - 84.28 - - 66
Philipine - - 65 64.8 58.1
Việt Nam - - - - 100
Indonexia - - 349.6 422.4 714.1
(-) số liệu không đợc xác định
1.1.3. Phân bố
ở nớc ta đu đủ đợc trồng trong vờn nhà ( từ 5 đến 10 cây) của gần 50% hộ
nông dân. Đu đủ cũng đợc trồng tập trung trong các nông trờng hoặc trang trại
vùng đồng bằng sông hồng, ven biển miền trung, đồng bằng sông Mekong và sờn
núi đá vôi. Tổng diện tích vào khoảng 2500 ha gồm khoảng 1250 ha trồng tập
trung (Bảng 3) và 1250 ha trồng trong vờn nhà
Bảng 3: Vùng phân bố tập trung của cây đu đủ ở Việt Nam
Vùng phân bố Diện tích (ha)
Vùng núi và trung du phía bắc
- Sơn La
- Lạng Sơn
500
Đồng bằng sông Hồng
- Hà Nội
- Hng Yên
- Nam Hà
- Ninh Bình
250
Ven biển miền trung
- Nghệ An
100
7
- Thanh hoá
Đồng bằng sông Mekong
- Ninh Thuận
- Nha Trang
- Tây Ninh
- Tiền Giang
500-550
1.1.4. Các bệnh và sâu hại của cây đu đủ
- Bệnh đốm vòng: Hạn chế lớn nhất đối với sự phát triển cây đu đủ là sự
hoành hành của bệnh đốm vòng do virus đốm vòng (papaya ringspot virus) gây ra.
Khi virus này nhiễm vào cây đu đủ thì lá cây có những vòng đốm, các gân lá xoăn
lại và phồng lên làm mất khả năng quang hợp, ở quả có những vòng xanh ô lu. Cây
chậm phát triển dẫn đến giảm nghiêm trọng năng suất và chất lợng quả. Bệnh đợc
truyền do các loại rệp cây nên lan rộng rất nhanh. Hiện nay tất cả các vùng trồng
đu đủ ở nớc ta đều đã bị nhiễm bệnh kể cả khi lấy hạt của những cây đu đủ không
bị bệnh đem gieo thì cũng chỉ khoảng 4- 5 tháng sau khi trồng cha kịp thu hoạch
đã thấy xuất hiện triệu trứng bệnh.
- Rệp sáp, rệp mình mềm, bọ nhảy ngoài việc hút nhựa gây tác hại trực
tiếp còn là vật truyền bệnh PRSV nhất thiết phải trị bằng những thuốc hiện có nh
Bi 58ND, Mipcin 20ND, Trebon 10ND, Applaud-BAM 50ND Những cây đu đủ
trồng lẻ tẻ, không chăm sóc có rất nhiều loại côn trùng và thực sự là những ổ dịch
nếu không phá bỏ thì nghề trồng đu đủ rất khó phát triển.
- Tuyến trùng: tấn công vào rễ, gây những nốt sần. Bệnh bị nặng ở nơi đất
cát, nơi đã trồng đu đủ nhiều vụ. Phòng trị bằng luân canh, đổ formalin 4% 25cc
vào mỗi hố trồng.
- Nhện đỏ: Gây hại chủ yếu vào mùa khô, đẻ trứng ở phía dới lá, cả sâu non
và sâu trởng thành đều hút nhựa làm cho phiến lá mất diệp lục, chuyển màu vàng.
Trị bằng Kelthane hoặc nếu không dùng Trebon phun vào dới lá.
- Bệnh nấm Helminthosporium: gây cháy lá làm cho lá bị biến màu và khô
rụng (Phun Kitazin 0,2% có thể hỗn hợp với vôi 1%)
- Bệnh phấn trắng: do nấm Oidium caricae gây ra (phun Benomyl, Zineb và
cácthuốc thuộc nhóm lu huỳnh)
8
- Bệnh nấm Phytophtora: Vừa hại rễ, vừa hại quả. Nấm ở trong đất khó
phòng trị, ở Hawaii ngời ta dùng thuốc xông hơi để trị. Tạo những điều kiện không
thuận lợi cho nấm phát triển nh: trồng trên lip đất cao, luân canh, tránh cuốc xới
làm đứt rễ.
1.2. Đặc điểm của PRSV
1.2.1 Cấu trúc
PRSV thuộc loại potyvirus, nhóm gồm có khoảng 160 loại khác nhau.
Nhóm potyvirus là lớn nhất và quan trọng nhất về sự ảnh hởng đến kinh tế của
virus gây bệnh ở thực vật. Những virus của nhóm này có genome là sợi RNA đơn
cuốn vòng với kích thớc 780x12nm. Nó chứa khoảng 10kb liên kết với protein ở
đầu 5' (VPg) và có đuôi polyA đầu 3' (Shukla et.al 1994). Sợi RNA genome này đ-
ợc bao bọc bằng vỏ protein (Capsid). Vỏ protein là sự lặp lại của những tiểu phần
nhỏ là protein vỏ (coat protein). RNA genome của PRSV đợc dịch mã trong tế bào
chủ tạo ra polyprotein. Polyprotein này thuỷ phân tạo ra 12 protein trong đó có
protein vỏ (viral coat protein).
Trong suốt quá trình nhiễm trong tế bào chủ, virus sử dụng nguyên liệu của
tế bào chủ để tạo ra những bản sao genome cũng nh các protein của nó. Sau đó
RNA và những tiểu phần protein vỏ tự lắp ráp với nhau tạo ra những virus hoàn
chỉnh riêng biệt có khả năng nhiễm sang các tế bào khác trong cây hoặc sang các
cây khác nhờ côn trùng.
Genome của virus mã hoá khoảng 12 loại protein. Một vài loại thì chức
năng của nó không hoàn toàn đợc xác định, một vài loại thì có nhiều chức năng
khác nhau. Một số chức năng đã đợc xác định là vỏ protein, nhân, thân hình trụ,
phần bổ trợ liên quan đến sự truyền nhờ côn trùng, helicase và nhiều protease,
replicase, protein liên kết genome, ATPase.
1.2.2. Cơ chế lan truyền của PRSV
PRSV đợc truyền dễ dàng đến tế bào chủ thân thuộc nhờ nhiều loài rệp cây
khác nhau với phơng thức không liên tục. Virus đợc truyền không liên tục nhờ rệp
cây là vì sự tồn tại trong vật truyền trung gian là rất ngắn, ngắn hơn cả thời gian
9
tồn tại của virus trong dịch chiết lá cây. Trong quá trình truyền không liên tục,
virus đợc truyền sang côn trùng sau khi sinh trởng một thời gian ngắn trong cây bị
nhiễm và có thể đợc truyền tới một hoặc vài cây ngay lập tức hay sau nhiều giờ. Có
sự khác nhau trong vật truyền đặc hiệu của từng loại virus riêng biệt trong nhóm
thậm chí giữa các dạng sinh học của cùng một loại virus. Điều này nói lên rằng cơ
chế của sự tơng tác virus - vector vợt ra ngoài tính chất sinh học chung của virus và
vector truyền của nó [ ].
1.2.3. Các biện pháp phòng trừ
- Sử dụng các chất hoá học tiêu diệt rệp truyền bệnh.
- Loại bỏ các cây bị bệnh, tránh trồng gần các cây họ bầu bí là ký chủ của
các côn trùng truyền bệnh.
- Cách ly với các vùng có cây bị bệnh. Các vùng cách ly có thể tạm thời
không bị bệnh nhng do sự bùng phát của PRV thì các vùng trên cũng sẽ bị nhiễm.
Điều này thấy rõ ở các vùng trồng đu đủ qui mô lớn ở Hawaii (isherwood,1994)
Các phơng pháp này chỉ áp dụng đợc khi cây cha bị nhiễm bệnhvà mang
tính chất phòng trừ chứ không thể chống lại đợc bệnh này
- Cơ chế kháng chéo: sử dụng một chủng PRV yếu cho nhiễm vào cây (ví
dụ chủng HA5-1) để ngăn chặn sự lây nhiễm của các chủng PRV mạnh hơn. Nhợc
điểm của phơng pháp này là các cây bị nhiễm chủng PRV yếu tuy có các dấu hiệu
bị bệnh nhẹ hơn nhng thiệt hại về sản lợng cũng lên tới 10-20%.(Yeh và
Gonsalves, 1994).
1.2.4. Gen kháng virus
Từ nhiều năm, ngời ta đã biết cây cỏ có thể trở nên kháng đối với các chủng
virus gây bệnh nếu trớc đó gây nhiễm chúng với cùng loại hay với virus tơng tự.
Hiện tợng này gọi là bảo vệ chéo. Hình nh protein vỏ của thể virus đóng vai trò
quyết định đối với tính kháng chéo, bởi vì khi gen CP của nhiều loại virus RNA đ-
ợc thể hiện trong cây (cũng không nhất thiết phải có sự biểu hiện gen mã hoá
protein vỏ ở mức độ cao) thì phản ứng bảo vệ chéo biểu hiện. Tính kháng virus còn
có thể đạt đợc khi biến nạp thực vật với DNA có những đoạn mã hoá RNA vệ tinh.
Cơ chế bảo vệ chéo còn cha đợc giải thích đầy đủ nhng có thể giả thiết rằng giữa
10
thể virus gây nhiễm và tế bào chủ có sự hoà trộn sản phẩm biểu hiện của gen nên
đã tạo ra tính kháng virus của cây.
Bằng việc sử dụng các tiến bộ trong kỹ thuật di truyền, ngời ta đã chuyển
gen CP của virus vào giống đu đủ, tạo cho cây có khả năng kháng bệnh virus. Đây
là một thành tựu lớn của công nghệ sinh học trong việc chống lại bệnh PRSV. Các
dòng đu đủ chuyển gen này sẽ góp phần có hiệu quả trong việc phòng trừ bệnh
PRSV.
1.2.5. Những thành tựu trong việc chống lại PRSV ở cây đu đủ
Trên thế giới đã có nhiều phòng thí nghiệm làm về chuyển gen ở thực vật,
nhng đối với sự chuỷên gen CP để tạo cây kháng PRSV thì chỉ có một số phòng thí
nghiệm nổi bật là:
1.2.5.1. Trờng đại học Hawaii và đại học Cornell, Mỹ
Hai nơi này đã đi tiên phong trong việc chuyển gen CP vào đu đủ để kháng
bệnh đốm vòng và đã mở ra một phơng pháp mới cho việc tạo các giống cây trồng
kháng bệnh virus. Nhóm các nhà khoa học gồm có:
Dr. Dennis Gonsalves, Khoa bệnh học thực vật, đại học Cornell, tham gia
trong việc tách phân lập gen CP từ virus PRSV.
Dr. Jerry Slightom thiết kế cấu trúc gene CP dùng cho chuyển gen
Dr. Maureen Fitch (USDA) chuyển gen CP vào đu đủ.
Dr. Richarh Manshardt, Khoa trồng trọt, đại học Hawaii, tham gia kiểm tra
và khảo nghiệm các dòng cây chuyển gen.
Nhóm nghiên cứu này đã đa Gen CP của dòng virus PRSV HA 5-1 vào
vector pGA482 và chuyển thành công vào giống đu đủ "Sunset" bằng súng bắn
gen. Họ đã tạo ra hai dòng đu đủ mang tên 55-1 và 63-1 có mang gen CP trong
genom và đã kiểm tra bằng lai Southern và ELISA. Kết quả thử nghiệm khả năng
kháng bệnh của thế hệ R1 từ dòng 55-1 cho thấy nó có tính kháng bệnh rất cao
(chỉ có 5% của 128 cây đợc thử nhiễm bệnh) đối với các dòng virus tách từ
Hawaii. Nhng không kháng đợc các dòng tách từ nơi khác (vd: Thailand). Vì thịt
quả của dòng 55-1 có mầu hồng không phù hợp với thị trờng nên dòng 55-1 này đã
đợc lai với giống Kapoho tạo ra dòng "Rainbow" có thịt quả mầu vàng mang đầy
11
đủ các đặc tích của giống gốc. Hiện nay dòng "Rainbow" đã đợc đăng ký bản
quyền và trở thành giống đu đủ chuyển gen thơng mại đầu tiên có khả năng kháng
lại PRSV.
1.2.5.2 Trờng đại học Kasetsart, Thailand và Queensland, Austrailia
Nhóm nghiên cứu gồm có:
Dr. Tom Burn, Dr. Kanokawan Kanokawaree, Dr. Supart Attathom
Đại học Kasetsart, Thailand
Dr. Srimake Chaowphongphang, đại học Queensland, Austrailia.
Để kiểm soát bệnh PRV thì từ năm 1987 Thailand đã tạo ra các giống có
khả năng chịu bệnh cao theo phơng pháp bảo vệ chéo nhng hiệu quả không cao.
Năm 1995, Thailand đã có chơng trình phát triển cây đu đủ chuyển gen kháng
bệnh PRSV đợc tài trợ của ACIAR kết hợp giữa trờng đại học Kasetsart, Thailand
và Queensland, Austrailia.
Gen CP đã đợc tách từ các chủng virus của Thailand. Gen này đợc chuyển
vào hai giống Khak-Dum và Khak-Nual bằng phơng pháp bắn gen với nguyên liệu
là phôi non qua giai đoạn mô sẹo. Hiện nay họ cũng đã thu đợc cây chuyển gen,
đang thử nghiệm tính kháng PRSV.
1.2.5.3. Trung tâm Công nghệ sinh học, MARDI, Malaysia
Nhóm nghiên cứu gồm
Dr. Hassan Matd Daud tách phân lập gen CP từ các chủng virus của Malaysia.
Dr. Tan Chong Seng thiết kế cấu trúc CP gen, đa vào vector p2K7 dùng cho
chuyển gen bằng súng bắn gen và vector pCAMBIA2300 dùng cho chuyển gen
bằng Agrobacterium.
Dr. Vilasini Pillai: chuyển gen CP vào giống đu đủ Ekotika.
Hiện nay đã thu đợc cây chuyển gen Ro đợc khẳng định bằng lai southern nhng
cha đợc thử khả năng kháng bệnh.
1.3. Sinh học phân tử và ứng dụng để tạo cây chuyển gen
1.3.1. Một số vector sử dụng trong sinh học phân tử
12
1.3.1.1. Vector nhân dòng TA- cloning
Vector này đợc thiết kế riêng cho việc nhân dòng và xác định trình tự
nucleotit của một đoạn gen nào đó. Do tính chất của sản phẩm phản ứng PCR khi
sử dụng enzim Taq DNA polymerase để nhân lên một đoạn gen nào đó thì bao giờ
trên mỗi mạch đơn hai đầu của sản phẩm cũng gắn d thêm một dATP vào nên
vector TA-cloning đợc thiết kế dạng mở và trên mỗi mạch đơn ở hai đầu có gắn
thêm một dTTP. Vì vậy, đoạn DNA sản phẩm của phản ứng PCR có thể gắn trực
tiếp vào vector nhờ T4 ligase. Xung quanh điểm chèn đoạn DNA này có vị trí nhận
biết của một số enzim giới hạn để dễ dàng cho việc thiết kế cấu trúc gene sau này.
Phía trái của điểm chèn đoạn DNA là lac promoter cho việc biểu hiện của gen
lacZ, trùm qua điểm chèn là đoạn gen lacZ mã hoá 146 a xít amin của -
galactosidase giúp cho việc chon lọc khuẩn lạc xanh/trắmg. Vector này mang vùng
gen tự sao mã ColE1 origin biểu hiện số lợng cao bản sao trong E.coli và gen chọn
lọc là hai gen kháng kanamycin và Ampicillin. Đặc biệt, có trình tự bắt cặp bổ
sung của hai đoạn mồi M13 forward và M13 reverse nằm ở hai bên của điểm chèn
phục vụ cho việc xác đinh trình tự đoạn DNA đợc chèn vào (hình )
Hình : Bản đồ vector TA-cloning pCR2.1
13
1.3.1.2. Vector biểu hiện protein pRSET
Vector pRSET có nguồn gốc là các vector biểu hiện pUC, đợc thiết kế cho
sự biểu hiện protein và tinh chế protein ở mức độ cao trong E. coli. Sự biểu hiện ở
mức độ cao của các trình tự DNA đợc đa vào vector pRSET đợc tạo ra do sự điều
khiển của T7 promoter. Đoạn DNA đợc đa vào vị trí trong khung dịch mã với trình
tự mã hoá đoạn peptid tín hiệu tận cùng đầu N, một bộ mã khởi đầu dịch mã ATG,
một đoạn trình tự mã hoá 6 a xít amin histidine có chức năng là vùng liên kết với
kim loại trong protein đợc dịch mã. Vùng liên kết kim loại của đoạn peptide tín
hiệu cho phép tinh chế protein tái tổ hợp một cách đơn giản bằng sắc ký ái lực.
Một đoạn trình tự có tính năng làm ổn định cho sự sao mã có nguồn gốc từ gen 10
của phagơ T7. Một đoạn trình tự qui định vị trí cắt của enzim enterokinase trên
chuỗi peptide nằm giữa vùng liên kết với kim loại và protein tái tổ hợp, có tác dụng
loại bỏ đoạn peptide tín hiệu đầu N từ protein tái tổ hợp đã tinh sạch.
Trong pRSET, vị trí MCS (multiple cloning site) có vị trí cắt của 10 enzim
giới hạn: BamH I; Xho I; Bgl II; Pst I; Pvu II; Kpn I; Nco I; EcoR I; BstB I và Hind
III. Theo đó, để tạo ra đúng protein tái tổ hợp chá đoạn pepetide tín hiệu cần phải
chèn đoạn DNA vào một trong những vị trí trong MSC sao cho đúng khung dịch
mã với mã khởi đầu ATG của vector. Vector pRSET có 3 loại pRSET A, B và C
(hình 2) chỉ khác nhau đoạn trình tự giữa vùng mã cho đoạn peptide tín hiệu và
MCS. Để biểu hiện đúng protein đã đợc mã hoá bởi trình tự DNA, yếu tố quyết
định đầu tiên là vị trí cắt giới hạn phải thích hợp cho sự lai ghép đoạn DNA và sau
đó là vector nào sẽ duy trì đợc khung dịch mã của vector và đoạn DNA đợc chèn
vào.
Vector tái tổ hợp pRSET đợc chuyển vào E. coli TOP 10F để nhân dòng và
duy trì. Muốn biểu hiện protein tái tổ hợp thì cấu trúc vector này phải đợc chuyển
14
Không có nhận xét nào:
Đăng nhận xét